細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒
一,試劑盒組份
產(chǎn)品名稱 | 包裝50T | 包裝200T |
細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A | 10ml | 40ml |
細(xì)胞漿蛋白抽提試劑B | 0.5ml | 2.0ml |
細(xì)胞核蛋白抽提試劑 | 2.5ml | 10ml |
PMSF(100mM) | 1.5ml | 1.5ml |
說明書 | 1份 | 1份 |
二,說明
在研究細(xì)胞時(shí)經(jīng)常要研究細(xì)胞的不同組份,而研究得zui多的兩個(gè)細(xì)胞組份就是細(xì)胞核和細(xì)胞漿。分離細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞漿蛋白,不僅可以用于研究蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位,而且很多時(shí)候分離出來的核蛋白可以用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面的研究,例如EMSA(也稱gelshift),footprinting等。
細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒(Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)提供了一種比較簡(jiǎn)單、方便的從培養(yǎng)細(xì)胞或新鮮組織中抽提細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白的方法。約90分鐘就可以完成培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白的分離。抽提得到的蛋白可以用于Western,EMSA,footprinting,報(bào)告基因檢測(cè)以及酶活力測(cè)定等后續(xù)操作。
本試劑盒是通過細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A和B,在低滲透壓條件下,使細(xì)胞充分膨脹,然后破壞細(xì)胞膜,釋放出細(xì)胞漿蛋白,然后通過離心得到細(xì)胞核沉淀。zui后通過高鹽的細(xì)胞核蛋白抽提試劑抽提得到細(xì)胞核蛋白。
本試劑盒可以抽提50/200個(gè)樣品,每個(gè)樣品的數(shù)量為約二百萬細(xì)胞或約60毫克組織。
三,儲(chǔ)存條件:-20℃保存,一年有效。
四,操作步驟
1. 準(zhǔn)備溶液:溫融解試劑盒中的三種試劑,溶解后立即放置在冰上,混勻。取適當(dāng)量的細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A備用,在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF,使PMSF的zui終濃度為1mM。取適當(dāng)量的細(xì)胞核蛋白抽提試劑備用,在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF,使PMSF的zui終濃度為1mM。
2. 對(duì)于貼壁細(xì)胞:用PBS洗一遍,用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞,或用EDTA溶液處理細(xì)胞使細(xì)胞不再貼壁很緊,并用移液器吹打下細(xì)胞。離心收集細(xì)胞,盡zui大努力吸盡上清,留下細(xì)胞沉淀備用。盡量避免用胰酶消化細(xì)胞,以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。
3. 對(duì)于懸浮細(xì)胞:用PBS洗一遍,離心收集細(xì)胞,盡zui大努力吸盡上清,留下細(xì)胞沉淀備用。
4. 每20微升細(xì)胞沉淀加入200微升添加了PMSF的細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A。(對(duì)于二百萬Hela細(xì)胞,其細(xì)胞沉淀的體積大約為20微升或40毫克。)
5. zui高速劇烈Vortex 5秒,把細(xì)胞沉淀*懸浮并分散開。(如果細(xì)胞沉淀沒有*懸浮并分散開,可以適當(dāng)延長(zhǎng)vortex時(shí)間。)
6. 冰浴10-15分鐘。
7. 加入細(xì)胞漿蛋白抽提試劑B 10微升。zui高速劇烈Vortex 5秒,冰浴1分鐘。
8. zui高速劇烈Vortex 5秒,4℃ 12,000-16,000g離心5分鐘。
9. 立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中,即為抽提得到的細(xì)胞漿蛋白。可以立即使用,也可以凍存。(千萬不要觸及沉淀,可以在沉淀上方保留極小體積的上清,以免觸及沉淀。)
10. 對(duì)于沉淀,*吸盡殘余的上清,加入50微升添加了PMSF的細(xì)胞核蛋白抽提試劑。(不吸盡上清會(huì)帶來細(xì)胞漿蛋白的污染。)
11. zui高速劇烈Vortex 15-30秒,把細(xì)胞沉淀*懸浮并分散開。然后放回冰浴中,每隔1-2分鐘再高速劇烈Vortex 15-30秒,共30分鐘。
12. 4℃ 12,000-16,000g離心10分鐘。
13. 立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中,即為抽提得到的細(xì)胞核蛋白??梢粤⒓词褂茫部梢?70℃凍存。
14. 對(duì)于新鮮組織:
A. 把組織盡可能切成非常細(xì)小的碎片。按照20:1的比例混合適當(dāng)量的細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A和B(例如200微升細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A中加入10微升抽提試劑B)。并加入PMSF至zui終濃度為1mM配制成組織勻漿液。按照每60mg組織加入200微升組織勻漿液的比例混合組織和組織勻漿液,并在玻璃勻漿器內(nèi)充分勻漿。勻漿需在冰浴或4℃進(jìn)行。
B. 勻漿后把勻漿液轉(zhuǎn)移到塑料離心管內(nèi),冰浴放置15分鐘。
C. 4℃ 1,500g離心5分鐘。把上清轉(zhuǎn)移至一預(yù)冷的塑料管中,為抽提得到的部分細(xì)胞漿蛋白。(吸上清時(shí)千萬不要觸及沉淀。)
D. 對(duì)于沉淀,到了這一步已經(jīng)充分勻漿,但很多細(xì)胞還沒有破碎。接下去按照使用說明的步驟4開始操作,即把沉淀當(dāng)做已經(jīng)離心收集好的細(xì)胞沉淀操作,按照步驟4至步驟13抽提得到細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白。抽提得到的細(xì)胞漿蛋白可以和步驟14C中抽提得到的細(xì)胞漿蛋白合并。
五,注意事項(xiàng):
PMSF一定要在抽提試劑加入到樣品中前2-3分鐘內(nèi)加入,以免PMSF在水溶液中很快失效。
抽提蛋白的所有步驟都需在冰上或4℃進(jìn)行。
本試劑盒對(duì)于組織樣品,僅適合于新鮮組織,對(duì)凍存過的組織抽提效果很差。
使用本試劑盒抽提到的細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白均可直接用我們生產(chǎn)的BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。但不適合用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。
為了您的安全和健康,請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。